ヒトデの卵成熟と初期発生(受精・卵割）の観察 †

実験のねらいと特徴 †

ヒトデの卵成熟、受精、卵割を観察することで、『生物の初期発生過程のダイナミクス』を体験させる。

実験の流れ †

1. 準備
   1. 材料、試薬、器具の準備
   2. 限られた実験時間内に卵割過程を観察できるように、一部の卵を受精させておく。 詳細は『イトマキヒトデ受精法』
2. 前説明
   1. 棘皮動物ヒトデについて
   2. 減数分裂、受精、細胞分裂について
   3. スケッチの意義と描き方について
   4. 明視野顕微鏡の使い方について
3. 実験中
   1. ヒトデの卵成熟・受精・卵割過程の観察（レンズに海水が付かないように留意させる）。
4. 実験後
   1. レポート作成と提出
   2. 顕微鏡のレンズとステージの掃除

はじめに †

多くの生物は、卵と精子を介した有性生殖により新たな個体を作り出す。卵と精子は、遺伝子のセット(ゲノム)を一揃いのみ持つ生殖細胞である（図１）。精子が卵と融合し受精が成立した卵は、受精卵と呼ばれる。受精卵は分裂を繰り返すことで、細胞数を増やし、個体へと発生していく。私たちヒトにおいては、一個の受精卵から60兆個まで細胞が増殖する。各細胞は、ゲノム情報に基づき、形と機能を特異的に変化させ始め（細胞分化）、相互に作用し合うことで(細胞間相互作用)、それぞれの細胞が３次元的に構築された組織、器官を形成し（形態形成）、最終的に種に固有の形を作り出す。発生過程は、単相（n）の生殖細胞から複相（2n）の体細胞、さらに、組織、器官、個体へと階層が上る過程と特徴づけることができる。階層が上るに従って生物は複雑な構造を形成し、より高次の機能を獲得する。

図１．卵と精子の形成過程における核相 および倍数性 の変化

発生プログラムは、受精卵のゲノムに書き込まれており、世代を超えて正確に引き継がれる。すなわち、カエルの受精卵はカエルに、ヒトデの受精卵はヒトデになる。発生の各過程では、受精卵と同じ遺伝情報を持つ細胞たちが、位置と時を間違えずに多様な遺伝子を発現する。その中でも、発生の初期過程は、受精に向けて卵が成熟し、受精が成立した後、胚を構築する細胞の数が急速に増える時期である。これらの変化を顕微鏡下でじかに観察することをとおして、刻一刻と変化する発生の初期過程のダイナミクスを体験する。

目的と課題 †

• （目的１） ヒトデ卵成熟の観察
  • 課題１：卵核胞（germinal vesicle; GV）を有する未成熟卵を観察・スケッチする。
  • 課題２：未成熟卵を1-メチルアデニン（1-methyladenine;1-MA）で処理し、GVが崩壊して成熟卵となる過程を観察し、成熟卵をスケッチする。
• （目的２） 受精の観察
  • 課題３：受精膜の形成、および第1、第2極体の放出を観察し、受精卵をスケッチする。
• （目的３） 卵割の観察
  • 課題４：2細胞期、4細胞期の胚、ならびに細胞質分裂を進行している状態の胚をスケッチする。媒精からの経過時間も記録する。
• （目的４） 精子の観察
  • 課題５：ヒトデに特徴的な精子の頭部と尾部をスケッチする。

実験 †

材料 †

• イトマキヒトデ(Asterina pectinifera)の卵:
  未成熟卵（１シャーレ/８人）、サンプル１（１シャーレ/１人）、サンプル２（１シャーレ/１人）
• イトマキヒトデ(Asterina pectinifera)の精子懸濁液:
  受精用と観察用（試験管２本/８人）

試薬 †

• 1mM1-メチルアデニン　(1-MA;C6H7N5,MW=149.2):１０μl/１０ mlの海水中に入れた卵巣
• 海水、または人工海水（マリンアート）：２００ ml/８人

器具 †

• 光学顕微鏡（1台/1人）
• 直径６cmシャーレ（ヒトデ卵観察用）（２枚/１人）（サンプル１、サンプル２を入れて配布）
• パスツールピペット（３本/８人）
• ビニールテープ付きスライドガラス（1枚/1人）
• スライドガラス（1枚/1人）
• カバーガラス　（２枚/1人）
• 濾紙片　(適宜)

手順 †

1. 卵成熟（図４参照）　
   1. 1-メチルアデニン（１−MA）処理していない卵巣片から、卵をスペーサー付き観察用スライドガラス(図２)上にとり、カバーガラスをかけて、濾紙で余分な海水を吸い取り、100倍で顕鏡・スケッチする(注１)。
       

      図２．スペーサー付き観察用スライドガラス

       
   2. 15分前に1-メチルアデニン（１−MA）処理された卵巣片から得た卵（サンプル１）（図３）を、１０倍の対物レンズを使ってシャーレ中で顕鏡し、GVが崩壊していく様子を観察する(注２)。顕微鏡のステージが、メカニカルステージの場合には、クレンメルで挟んだスライドガラスの上にシャーレを乗せて顕鏡することで、シャーレ中の観察位置をスムーズに変えることができる(注３)。
       

      図３．ヒトデ卵成熟と初期発生のタイムスケジュール（19℃）(注８)

       
2. 極体形成・受精（図４参照）
   1. GVが崩壊したサンプル１のシャーレ中の卵細胞に、精子液を1滴加える。加えた時間をすぐに記録する。
   2. シャーレを静かに揺すって精子を撹拌し、その後に生じる受精膜、第一極体、第二極体の形成を１０倍の対物レンズを使ってシャーレ中で速やかに観察する(注４)。
   3. 各スケッチには、媒精からの経過時間を必ず記録する(注５)。
3. 卵割（図４参照）
   1. 30分前に媒精した卵巣片から得た卵（サンプル２）（図３）を、スペーサー付き観察用スライドガラス上にとり、カバーガラスをかけ、濾紙で余分な海水を吸い取り、100倍で顕鏡する。
   2. 2細胞期、4細胞期の胚を観察する。また、細胞質がくびれて、2細胞または4細胞になる過程（細胞質分裂中の様子）も観察する。各スケッチには、媒精からの経過時間を必ず記録する。
       

      図４．イトマキヒトデの卵成熟と初期発生

       
4. 精子（図５参照）
   1. 通常のスライドガラス上に精子液を1滴落とす。
   2. カバーガラスをかけ、余分な海水を濾紙で吸い取り、６００倍（対物レンズ40倍×接眼レンズ15倍）で顕鏡する(注６)。コンデンサーのフィルター上に遮光板を入れることで、簡易的な暗視野照明が可能になり、精子の頭部や尾部の形態が明瞭に観察できる(注７)。
       

      図５．イトマキヒトデの精子（微分干渉像）

       

ポイントやトラブルシューティング †

• 注1：卵がつぶれないように、ビニールテープで隙間を作ったスペーサー付きスライドガラスで観察する。
• 注２：シャーレのままの顕鏡では、対物レンズは10倍までにすること。レンズに海水がつかないようにくれぐれも注意する。海水がついた場合は、速やかにスタッフに伝え、レンズが腐食しないように丁寧にクリーニングする。（海水のついた部分を蒸留水で洗い、レンズペーパーを用いて、水分を完全に拭き取る）
• 注３：クレンメルがスムーズに作動するように、スライドガラス裏面に水がつかないように注意する。
• 注４：媒精約1分後に受精膜の上昇、続いて約１５分後に第一、第二極体形成が生じる。比較的に速い現象であるので、見落とさないように注意する。
• 注５：経過時間は時刻ではなく、媒精からの正味の時間を記述する。
• 注６：精子の観察は、通常のスライドガラスでおこなう。ビニールテープで隙間を作ったスライドガラスでは、精子が泳ぎ回って、観察しづらい。
• 注７：開口数が比較的小さな0.05〜0.6ぐらいの対物レンズを使用している場合は、適切な大きさの遮光板（例えば10円玉やレンズの大きさに合わせた黒っぽい紙）をコンデンサーレンズ上に乗せることにより、簡易暗視野照明が得られる。
• 注８：１℃の温度上昇でも、発生は速く進行するのでタイムスケールはあくまでも目安とし、注意して観察する。
  ★「顕微鏡の使い方」をよく読む。生きている細胞を観察しているので、光源の熱による水分の蒸発や温度上昇は、最小限になるようにくれぐれも注意する。
   

実験を成功させるための留意点 †

実験前

• 必要量のイトマキヒトデを用意し、タイムスケージュール（図３）に従って、１−MA処理や媒精を行う。余裕があれば、媒精の時間を15分程度ずらしたサンプルをいくつか用意するとよい。
• 未受精卵を扱うピペットは、精子を扱うピペットとしっかり区別し、誤って、未受精卵に精子が混ざらないようにする。

実験中

• 海水をレンズに付着させないよう注意を促す。

実験後

• 顕微鏡本体とレンズに海水がついていないか確認させる。

本実験の発展 †

• 『ヒトデの受精・形態形成におけるカルシウムイオンの役割』や『ヒトデの発生過程の観察』と組み合わせることができる。

資料 †

参考映像 †

• 画像をクリックするとPC内の動画再生ソフトにより直接動画が再生されます。
• 直接再生されない場合は、Windowsでは画像上で右クリック後、「対象ファイルを保存」し、保存したファイルを動画ソフトで再生してください。
• ファイル形式はmpg1です。

用語解説 †

有性生殖

精子と卵などの生殖細胞により新たな個体を作りだす方法

ゲノム

gene（遺伝子）とchromosome（染色体）の複合語であるゲノムgenomeは、個々の生物がもつ1組の遺伝情報を指す。

生殖細胞

新しい個体を形成し、次世代に遺伝情報を伝えうる生殖のために特別に分化した細胞。精子や卵子など。

核相

細胞1個にふくまれる染色体の状況を核相として表す。体細胞に見られるように相同染色体が存在する複相（２ｎ）と、生殖細胞に見られるような染色体が単独で存在する単相（ｎ）がある。

倍数性

1個の細胞に含まれるゲノムのセット数を倍数性として表す。

印刷用PDFマニュアル †

ヒトデの卵成熟と初期発生の観察.pdf