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イトマキヒトデの受精法

（lightboxで画像ウインドウが開きます）Tヒトデ受精法.jpg

関連実験テーマ：
ヒトデの卵成熟と初期発生(受精・卵割）の観察, など

はじめに

イトマキヒトデの受精法を１. 精子の単離、２. 卵の単離、３. 受精の3項目に分けて記述する。

材料

  • イトマキヒトデ（Asterina pectinifera）

試薬

  • 1 mM 1-methyladenine：分子量149.15
     
    1 mM 1-methyladenine　溶液 100 ml
    1-methyladenine 15 mg
    蒸留水 100 ml
  • 海水、または人口海水（マリンアートMARINEART®SF-1）300～500ml程度

器具

  • ハサミ　
  • ピンセット　
  • パスツールピペット　
  • ビーカー　
  • 直径9cmガラスシャーレ　
  • 15ml試験管　
  • 手回し遠心機　

手順

  1. イトマキヒトデの精子の単離
    1. オスのヒトデの腕の外皮にハサミを入れ、ピンセットで挟みだすようにして精巣を取り出す。
      (ヒトデは、雌雄異体で、その生殖巣は各腕の体腔に1対ずつ存在する。)
    2. 3 mlの海水が入った試験管に、取り出した精巣の一部を入れる。
    3. ii の海水をパスツールピペットで懸濁することで、精子を海水中に遊離させる。
       
  2. イトマキヒトデの卵の単離
    1. メスのヒトデの腕にハサミを入れ、オスの精巣と同様に卵巣を取りだす。
    2. 2腕分の卵巣を10 mlの海水が入った50mlビーカーに入れる。
    3. 上清が濁っていた場合、上清を捨て新たな海水に変える。(注１)
    4. iii のビーカーに1 mM 1-methyladenineを10 µl加え、良く攪拌し、15-20分処理する。
    5. 海水が入った９ｃｍシャーレに卵巣をピンセットで移し、ハサミを用いて細かく切断する。
    6. 卵巣から出てきた卵を観察し、卵核胞がなくなっている事をチェックする。
    7. 卵懸濁液を試験管に移し、手回し遠心機を用いて卵を集める。
    8. vii の上清を捨て、新たな海水10 mlで未受精卵を懸濁した後、500mlビーカーに移す。
       
  3. 受精法
    1. １. の作業で得た精子数滴（1-4滴）を ２.で準備した未受精卵懸濁液に加え、よく攪拌する。
    2. 受精膜を確認した後、未授精卵の体積1mlあたり(注２)、200-300mlの海水を加えて懸濁し、攪拌培養する（20 ℃, 30 rpm）。
    3. 20℃の温度条件で、64細胞期は4時間、胞胚は16時間、中期原腸胚は24時間、後期原腸胚は36時間、ビピンナリア幼生は60時間インキュベートすると、目的の発生ステージのサンプルが得られる。

ポイントやトラブルシューティング

  • 注１：濁ったまま作業を進めると、発生がうまく進まないことがあるので、濁った場合は、かならず海水を入れ替える。
  • 注２：本作業を実施するにあたっては、卵巣が充分に成熟した親個体を準備する必要がある。具体的には、5～7月は東京湾、9～12月は青森県陸奥湾産のイトマキヒトデが実験に使用できる。

印刷用PDFマニュアル

イトマキヒトデの受精法 pdf （211KB）

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