慶應義塾大学日吉キャンパス 特色GP 文系学生への実験を重視した自然科学教育
生物学実験/酵素反応の特質を知る
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開始行:
* 酵素反応の特質を知る ― 酵素チロシナーゼによるメラニン...
RIGHT:SIZE(9){画像をクリックすると拡大表示されます。}
#ref(生物学実験/タイトル画/Tチロシナーゼ.jpg,exif,right,w...
#contents
** 実験のねらいと特徴 [#e141373c]
ジャガイモからメラニン形成に重要な働きをする[[酵素>#term1...
*** 実験の流れ [#laabd39d]
+ 準備
++ [[材料>#mate]]、[[試薬>#chem]]、[[器具>#inst]]の準備
++ ジャガイモの切り分け (なるべく実習開始直前に行う)
+ 前説明
++ 酵素の特性について
++ チロシナーゼついて
++ [[ゲル濾過クロマトグラフィー>生物学実験/カラムの使い方...
++ チロシナーゼ分画の同定法
+ 実験中
++ ゲル濾過クロマトグラフィーによるチロシナーゼの分離
++ 比色検定によるチロシナーゼ分画の同定とその定性実験
+ 実験後
++ レポートの作成・提出
++ ゲル濾過カラムの洗浄と片付け
** はじめに [#lc93247e]
生物体は、様々な化学反応が複雑に組み合わさって生命を維持...
|&ref(fig1.jpg);&aname(fig1);|
|CENTER:''図1.酵素反応モデル''|
そのため、反応の数だけ、酵素が存在するといわれている。様...
酵素の本体はタンパク質であり、その基本構造は、アミノ酸...
チロシナーゼは、銅イオンと結合して活性をもつ酸化酵素の...
|&ref(fig2.jpg);&aname(fig2);|
|CENTER:''図2. チロシナーゼによるチロシンからメラニンへ...
** 目的と課題 [#v6d75d0d]
- ''(目的1)''ジャガイモの抽出液からゲル濾過カラムを用...
-- ''課題1'':分画の比色分析(Bセット、Cセット)の結果を...
-- ''課題2'':表1より、チロシナーゼを含む分画(チロシナ...
- ''(目的2)''[[表2>#table2]]の反応液において、酵素(...
-- ''課題3'':酵素の定性試験(Dセット)の結果を表にまと...
-- ''課題4'':Dセットの実験結果からどのようなことが言え...
-- ''課題5'':粗抽出液および酵素液(チロシナーゼ分画)は...
** 実験 [#xc2c5ab7]
***材料&aname(mate); [#vbd7b8f3]
-''ジャガイモ'':1片/2人(班)&br;小型のじゃがいもでは...
***試薬&aname(chem); [#ac640fce]
-''緩衝液'':9.57mMリン酸緩衝生理食塩水(PBS), pH7.35〜7....
-''300 mg/l チロシン溶液'':6ml/2人&br;
チロシンを少量の0.1N NaOHに溶かし、PBSを加える。 pHが高...
|BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(White):CENTER:チロシン溶液|BGCOLO...
|CENTER:チロシン|RIGHT:300 mg|~|~|
|CENTER:ドーパ|RIGHT:少量|~|~|
|CENTER:0.1N NaOH|RIGHT:少量|~|~|
|CENTER:1N HCl|RIGHT:少量|~|~|
|>|CENTER:PBSで1000 mlにメスアップ|~|~|
#br
-''300 mg/l フェニルアラニン溶液'':500μl/2人&br;
|BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(White):CENTER:フェニルアラニン溶...
|CENTER:フェニルアラニン|RIGHT:150 mg|~|~|
|>|CENTER:PBSで500 mlにメスアップ|~|~|
#br
-''1%ビタミンC溶液'':20 μl/2人&br;アスコルビン酸ナトリ...
-''タンパク質比色検定試薬'':5 ml /2人&br;Bio-Rad® P...
***器具&aname(inst); [#we031d9f]
-''おろし板'':1枚/2人(班)
-''シャーレ'':1枚/2人
-''ガーゼ'':28本/2人
-''1.5 ml マイクロチューブ'':1枚/人
-''チューブラック'':1個/2人
-''2ml [[駒込ピペット>生物学実験/駒込ピペットの使い方]]'...
-''[[ゲル濾過用カラム>生物学実験/カラムの使い方]]'':1本...
-''スタンド'':1台/2人
-''ビーカー'':1個/2人
-''[[マイクロピペッター>生物学実験/マイクロピペッターの使...
-''マジック '':1本/2人&br;
***手順 [#tc2fb834]
+ ''酵素液の調整''
++シャーレにガーゼを2枚敷き、その上に、ジャガイモをおろし...
++ガーゼの上から緩衝液10 mlを加えてシャーレに濾過する。ジ...
++1分間放置してデンプンを沈殿させる。シャーレを静かに傾...
#br
|&ref(fig3.jpg);&aname(fig3);|
|CENTER:''図3. 酵素液調整手順1:'' ジャガイモの処理|
#br
++スタンドに固定したゲル濾過用カラムの下にビーカーを置い...
++カラムの上部に入っていた緩衝液の水面がフィルターのとこ...
#br
|&ref(fig4.jpg);&aname(fig4);|
|CENTER:''図4. 酵素液調整手順2:'' カラムの準備|
#br
++8本のマイクロチューブ(Aセット)のフタに番号をつけ、ふ...
++P1000を用いて試験管内の粗抽出液を 500 μlとり、カラムの...
++カラムの下側のふたを開けて、溶出液をマイクロチューブに...
++粗抽出液が全てゲル内に移動したらすぐに、2mlの駒込ピペッ...
++カラム上部の緩衝液が半分くらいまで減ってきたら緩衝液を...
1のチューブに溶出液が1.5 ml(チューブ上部の線のところ)...
++溶出液の回収が終わったら、ビーカーを下に置き、約5 mlの...
++チューブのふたを閉めて5回くらい上下を逆さにしてよく混ぜ...
#br
|&ref(fig5.jpg);&aname(fig5);|
|CENTER:''図5. 酵素液調整手順3:''カラムの取扱い|
#br
+ ''分画の比色分析'' ([[図6>#fig6]])
++1〜8の番号をつけたチューブをBとCの2セット用意する。
++Bセットのチューブすべてにチロシン溶液(基質溶液)をP100...
++Cセットのチューブすべてにタンパク質比色検定試薬をP1000...
++Aセットのそれぞれの分画をBセットには50μl、Cセットには20...
++30分後に溶液の色の変化を調べる([[表1>#table1]])([[注...
#br
|&ref(fig6.jpg);&aname(fig6);|
|CENTER:''図6. 分画処理手順''|
#br
CENTER:&aname(table1);''表1.各分画における溶液の色''
|BGCOLOR(#c0504d): |>|>|>|>|>|>|>|BGCOLOR(#c0504d):C...
|~|BGCOLOR(#c0504d):COLOR(white): 1 ...
|CENTER:(B)チロシン溶液・処理前|||||||||
|CENTER:(B)チロシン溶液・処理後|||||||||
|CENTER:(C)比色検定試薬・処理前|||||||||
|CENTER:(C)比色検定試薬・処理後|||||||||
#br
+ ''酵素の定性試験''
++Dセットとして1〜4の番号を記したチューブを用意し、以下...
すべてのチューブに基質と阻害剤を入れたのち、酵素液を最後...
#br
CENTER:&aname(table2);''表2.定性試験の反応液の組成''
|BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(White):CENTER:チューブNo.|BGCOLOR...
|D-1|チロシン溶液|緩衝液|チロシナーゼ分画|
|D-2|チロシン溶液|緩衝液|緩衝液|
|D-3|フェニルアラニン溶液|緩衝液|チロシナーゼ分画|
|D-4|チロシン溶液|ビタミンC溶液|チロシナーゼ分画|
#br
++チロシナーゼ分画の処理前後(30分)の色の変化を調べる(...
#br
CENTER:&aname(table3);''表3.定性試験の結果''
|BGCOLOR(#c0504d): |>|>|>|BGCOLOR(#c0504d):COL...
|~|BGCOLOR(#c0504d):COLOR(white):CENTER: D-1&n...
|酵素溶液処理前|||||
|酵素溶液処理後|||||
#br
*** ポイントやトラブルシューティング [#xc812f69]
- &aname(attention1);[[注1>#attention1r]]:皮まですりお...
- &aname(attention2);[[注2>#attention2r]]:じゃがいもの...
- &aname(attention3);[[注3>#attention3r]]:上清には、デ...
- &aname(attention4);[[注4>#attention4r]]:カラムは、常...
- &aname(attention5);[[注5>#attention5r]]:沈殿している...
- &aname(attention6);[[注6>#attention6r]]:混ぜるとき、...
- &aname(attention7);[[注7>#attention7r]]:タンパク質比...
- &aname(attention8);[[注8>#attention8r]]:チロシナーゼ...
- &aname(attention9);[[注9>#attention9r]]:室温によって...
#br
*** 実験を成功させるための留意点 [#z5d78e87]
''実験前''
- チロシン溶液の調整法に注意する(詳しくは[[『試薬』>#che...
''実験中''
- ゲル濾過のためのカラム操作において、デンプンを入れない...
- カラム操作の前に必ずマイクロチューブに画分を示す番号を...
- 同じ反応時間で実験結果を比較させるために、酵素特性の実...
''実験後''
- タンパク質比色検定試薬は、所定の廃液ビンに集め、流しな...
- (a)酵素はどの分画にあったか、どうしてそう言えるのか、(b...
** 本実験の発展 [#hfd7a48b]
- 分子量に大差のある色素を用いて、ゲル濾過クロマトグラフ...
- 酵素反応の至適pHや温度を求める実験などに展開させること...
- 熱による変性、基質特異性などの酵素の性質を確かめるため...
**資料 [#j82028fe]
*** 用語解説 [#k9a4e043]
:&aname(term1);[[酵素>#term1r]]|生体内での化学反応を触媒...
:&aname(term2);[[触媒>#term2r]]|化学反応の反応速度を速め...
:&aname(term3);[[ゲル濾過クロマトグラフィー>#term3r]]|カ...
([[『ゲル濾過クロマトグラフィーの使い方』>生物学実験/カ...
:&aname(term4);[[基質特異性>#term4r]]|特定の基質の立体構...
*** 印刷用PDFマニュアル [#h0f882fc]
&ref(酵素反応の特質を知る.pdf);
終了行:
* 酵素反応の特質を知る ― 酵素チロシナーゼによるメラニン...
RIGHT:SIZE(9){画像をクリックすると拡大表示されます。}
#ref(生物学実験/タイトル画/Tチロシナーゼ.jpg,exif,right,w...
#contents
** 実験のねらいと特徴 [#e141373c]
ジャガイモからメラニン形成に重要な働きをする[[酵素>#term1...
*** 実験の流れ [#laabd39d]
+ 準備
++ [[材料>#mate]]、[[試薬>#chem]]、[[器具>#inst]]の準備
++ ジャガイモの切り分け (なるべく実習開始直前に行う)
+ 前説明
++ 酵素の特性について
++ チロシナーゼついて
++ [[ゲル濾過クロマトグラフィー>生物学実験/カラムの使い方...
++ チロシナーゼ分画の同定法
+ 実験中
++ ゲル濾過クロマトグラフィーによるチロシナーゼの分離
++ 比色検定によるチロシナーゼ分画の同定とその定性実験
+ 実験後
++ レポートの作成・提出
++ ゲル濾過カラムの洗浄と片付け
** はじめに [#lc93247e]
生物体は、様々な化学反応が複雑に組み合わさって生命を維持...
|&ref(fig1.jpg);&aname(fig1);|
|CENTER:''図1.酵素反応モデル''|
そのため、反応の数だけ、酵素が存在するといわれている。様...
酵素の本体はタンパク質であり、その基本構造は、アミノ酸...
チロシナーゼは、銅イオンと結合して活性をもつ酸化酵素の...
|&ref(fig2.jpg);&aname(fig2);|
|CENTER:''図2. チロシナーゼによるチロシンからメラニンへ...
** 目的と課題 [#v6d75d0d]
- ''(目的1)''ジャガイモの抽出液からゲル濾過カラムを用...
-- ''課題1'':分画の比色分析(Bセット、Cセット)の結果を...
-- ''課題2'':表1より、チロシナーゼを含む分画(チロシナ...
- ''(目的2)''[[表2>#table2]]の反応液において、酵素(...
-- ''課題3'':酵素の定性試験(Dセット)の結果を表にまと...
-- ''課題4'':Dセットの実験結果からどのようなことが言え...
-- ''課題5'':粗抽出液および酵素液(チロシナーゼ分画)は...
** 実験 [#xc2c5ab7]
***材料&aname(mate); [#vbd7b8f3]
-''ジャガイモ'':1片/2人(班)&br;小型のじゃがいもでは...
***試薬&aname(chem); [#ac640fce]
-''緩衝液'':9.57mMリン酸緩衝生理食塩水(PBS), pH7.35〜7....
-''300 mg/l チロシン溶液'':6ml/2人&br;
チロシンを少量の0.1N NaOHに溶かし、PBSを加える。 pHが高...
|BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(White):CENTER:チロシン溶液|BGCOLO...
|CENTER:チロシン|RIGHT:300 mg|~|~|
|CENTER:ドーパ|RIGHT:少量|~|~|
|CENTER:0.1N NaOH|RIGHT:少量|~|~|
|CENTER:1N HCl|RIGHT:少量|~|~|
|>|CENTER:PBSで1000 mlにメスアップ|~|~|
#br
-''300 mg/l フェニルアラニン溶液'':500μl/2人&br;
|BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(White):CENTER:フェニルアラニン溶...
|CENTER:フェニルアラニン|RIGHT:150 mg|~|~|
|>|CENTER:PBSで500 mlにメスアップ|~|~|
#br
-''1%ビタミンC溶液'':20 μl/2人&br;アスコルビン酸ナトリ...
-''タンパク質比色検定試薬'':5 ml /2人&br;Bio-Rad® P...
***器具&aname(inst); [#we031d9f]
-''おろし板'':1枚/2人(班)
-''シャーレ'':1枚/2人
-''ガーゼ'':28本/2人
-''1.5 ml マイクロチューブ'':1枚/人
-''チューブラック'':1個/2人
-''2ml [[駒込ピペット>生物学実験/駒込ピペットの使い方]]'...
-''[[ゲル濾過用カラム>生物学実験/カラムの使い方]]'':1本...
-''スタンド'':1台/2人
-''ビーカー'':1個/2人
-''[[マイクロピペッター>生物学実験/マイクロピペッターの使...
-''マジック '':1本/2人&br;
***手順 [#tc2fb834]
+ ''酵素液の調整''
++シャーレにガーゼを2枚敷き、その上に、ジャガイモをおろし...
++ガーゼの上から緩衝液10 mlを加えてシャーレに濾過する。ジ...
++1分間放置してデンプンを沈殿させる。シャーレを静かに傾...
#br
|&ref(fig3.jpg);&aname(fig3);|
|CENTER:''図3. 酵素液調整手順1:'' ジャガイモの処理|
#br
++スタンドに固定したゲル濾過用カラムの下にビーカーを置い...
++カラムの上部に入っていた緩衝液の水面がフィルターのとこ...
#br
|&ref(fig4.jpg);&aname(fig4);|
|CENTER:''図4. 酵素液調整手順2:'' カラムの準備|
#br
++8本のマイクロチューブ(Aセット)のフタに番号をつけ、ふ...
++P1000を用いて試験管内の粗抽出液を 500 μlとり、カラムの...
++カラムの下側のふたを開けて、溶出液をマイクロチューブに...
++粗抽出液が全てゲル内に移動したらすぐに、2mlの駒込ピペッ...
++カラム上部の緩衝液が半分くらいまで減ってきたら緩衝液を...
1のチューブに溶出液が1.5 ml(チューブ上部の線のところ)...
++溶出液の回収が終わったら、ビーカーを下に置き、約5 mlの...
++チューブのふたを閉めて5回くらい上下を逆さにしてよく混ぜ...
#br
|&ref(fig5.jpg);&aname(fig5);|
|CENTER:''図5. 酵素液調整手順3:''カラムの取扱い|
#br
+ ''分画の比色分析'' ([[図6>#fig6]])
++1〜8の番号をつけたチューブをBとCの2セット用意する。
++Bセットのチューブすべてにチロシン溶液(基質溶液)をP100...
++Cセットのチューブすべてにタンパク質比色検定試薬をP1000...
++Aセットのそれぞれの分画をBセットには50μl、Cセットには20...
++30分後に溶液の色の変化を調べる([[表1>#table1]])([[注...
#br
|&ref(fig6.jpg);&aname(fig6);|
|CENTER:''図6. 分画処理手順''|
#br
CENTER:&aname(table1);''表1.各分画における溶液の色''
|BGCOLOR(#c0504d): |>|>|>|>|>|>|>|BGCOLOR(#c0504d):C...
|~|BGCOLOR(#c0504d):COLOR(white): 1 ...
|CENTER:(B)チロシン溶液・処理前|||||||||
|CENTER:(B)チロシン溶液・処理後|||||||||
|CENTER:(C)比色検定試薬・処理前|||||||||
|CENTER:(C)比色検定試薬・処理後|||||||||
#br
+ ''酵素の定性試験''
++Dセットとして1〜4の番号を記したチューブを用意し、以下...
すべてのチューブに基質と阻害剤を入れたのち、酵素液を最後...
#br
CENTER:&aname(table2);''表2.定性試験の反応液の組成''
|BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(White):CENTER:チューブNo.|BGCOLOR...
|D-1|チロシン溶液|緩衝液|チロシナーゼ分画|
|D-2|チロシン溶液|緩衝液|緩衝液|
|D-3|フェニルアラニン溶液|緩衝液|チロシナーゼ分画|
|D-4|チロシン溶液|ビタミンC溶液|チロシナーゼ分画|
#br
++チロシナーゼ分画の処理前後(30分)の色の変化を調べる(...
#br
CENTER:&aname(table3);''表3.定性試験の結果''
|BGCOLOR(#c0504d): |>|>|>|BGCOLOR(#c0504d):COL...
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|酵素溶液処理前|||||
|酵素溶液処理後|||||
#br
*** ポイントやトラブルシューティング [#xc812f69]
- &aname(attention1);[[注1>#attention1r]]:皮まですりお...
- &aname(attention2);[[注2>#attention2r]]:じゃがいもの...
- &aname(attention3);[[注3>#attention3r]]:上清には、デ...
- &aname(attention4);[[注4>#attention4r]]:カラムは、常...
- &aname(attention5);[[注5>#attention5r]]:沈殿している...
- &aname(attention6);[[注6>#attention6r]]:混ぜるとき、...
- &aname(attention7);[[注7>#attention7r]]:タンパク質比...
- &aname(attention8);[[注8>#attention8r]]:チロシナーゼ...
- &aname(attention9);[[注9>#attention9r]]:室温によって...
#br
*** 実験を成功させるための留意点 [#z5d78e87]
''実験前''
- チロシン溶液の調整法に注意する(詳しくは[[『試薬』>#che...
''実験中''
- ゲル濾過のためのカラム操作において、デンプンを入れない...
- カラム操作の前に必ずマイクロチューブに画分を示す番号を...
- 同じ反応時間で実験結果を比較させるために、酵素特性の実...
''実験後''
- タンパク質比色検定試薬は、所定の廃液ビンに集め、流しな...
- (a)酵素はどの分画にあったか、どうしてそう言えるのか、(b...
** 本実験の発展 [#hfd7a48b]
- 分子量に大差のある色素を用いて、ゲル濾過クロマトグラフ...
- 酵素反応の至適pHや温度を求める実験などに展開させること...
- 熱による変性、基質特異性などの酵素の性質を確かめるため...
**資料 [#j82028fe]
*** 用語解説 [#k9a4e043]
:&aname(term1);[[酵素>#term1r]]|生体内での化学反応を触媒...
:&aname(term2);[[触媒>#term2r]]|化学反応の反応速度を速め...
:&aname(term3);[[ゲル濾過クロマトグラフィー>#term3r]]|カ...
([[『ゲル濾過クロマトグラフィーの使い方』>生物学実験/カ...
:&aname(term4);[[基質特異性>#term4r]]|特定の基質の立体構...
*** 印刷用PDFマニュアル [#h0f882fc]
&ref(酵素反応の特質を知る.pdf);
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