慶應義塾大学日吉キャンパス 特色GP 文系学生への実験を重視した自然科学教育
生物学実験/ショウジョウバエによる統合的遺伝学実験
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* ショウジョウバエによる統合的遺伝学実験 [#he345cef]
RIGHT:SIZE(9){画像をクリックすると拡大表示されます。}
#ref(生物学実験/タイトル画/Tショウジョウバエ.jpg,exif,rig...
#contents
作成中
** 実験のねらいと特徴 [#g72cf6ee]
遺伝の学習で重要な「遺伝子発現」と「遺伝の法則」を、同時...
ライフサイクルが比較的短いショウジョウバエを使って、メン...
*** 実験の流れ [#bcdd38a7]
+ 準備
++ ショウジョウバエ 雑種第1代(F&subsc{1};)、第2代(F...
++ 材料、試薬、器具の準備
+ 前説明
++ メンデル遺伝の法則
++ ショウジョウバエの取扱い方
++ アルコール脱水素酵素と測定法について
++ DNAの抽出法とPCR法について
++ 電気泳動の方法ついて
+ 実験中
++ ショウジョウバエの形態観察
++ 酵素活性の測定による表現型の判定
++ DNA抽出
++ PCR法によるDNA増幅
++ 電気泳動による遺伝子型の判定
+ 実験後
++ レポート作成と提出
++ 片付け
** はじめに [#c5bef753]
ショウジョウバエは飼育が容易で世代時間が短く、多くの...
この実験では、ショウジョウバエにもヒトにも存在するアルコ...
#br
|CENTER:&ref(ADH.jpg);&aname(fig1);|
|CENTER:''図1.アルコール脱水素酵素(ADH)の反応''|
|LEFT:NAD&super{+ };:ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド...
#br
野生のショウジョウバエは、酵母を栄養源としているので...
#br
|CENTER:&ref(ゲノム配列.jpg);&aname(fig2);|
|CENTER:''図2.ショウジョウバエ'''Adh'''遺伝子多型検出の...
#br
一方、遺伝子型の判定は、ADH活性の有無だけではわからな...
PCR法はサンプルから抽出したDNA(今回はショウジョウバエゲ...
#br
|CENTER:&ref(fig-1.jpg);&aname(fig3);|
|CENTER:''図3.ショウジョウバエ'''Adh'''遺伝子多型検出の...
|CENTER:プライマー(1)、(4)は野生型、変異型で共通。|
#br
** 目的と課題 [#r71b38d9]
- ''(目的1)''酵素活性の有無を測定し、交配で得た雑種第...
-- ''課題1'':ショウジョウバエの雄雌の違いを観察し、スケ...
-- ''課題2'':アルコール脱水素酵素の活性を測定し、結果を...
- ''(目的2)''PCR法で増幅した1個体のDNAを電気泳動するこ...
-- ''課題3'':1個体からDNAを抽出し、PCRにかける。
-- ''課題4'':増幅したDNAサンプルを電気泳動にかけ、バン...
** ショウジョウバエの形態の観察 [#vb5fdad6]
***材料[#cabcdfdb]
-''ショウジョウバエ('''Drosophila melanogaster''')'':...
***試薬[#rb45b5c3]
-''ジエチルエーテル''
***器具[#m65ed5ac]
-''ルーペまたは[[実体顕微鏡>生物学実験/実体顕微鏡の使い方...
-''麻酔瓶''(ジエチルエーテル入り)
-''白色タイル'':観察・作業台
-''竹ひご または平筆'':ハエを扱うのに用いる
-''マウスパッド'':ハエを瓶の底に集めるときに用いる。
***手順 [#qe9a41ca]
+ 麻酔瓶にジエチルエーテルを2〜3滴スポイトで垂らす([[注...
+ ハエの入ったバイアルをマウスパッドの上などで、軽く叩い...
+ ハエが落ちたことを確認後、バイアルの蓋をあけ、麻酔瓶の...
+ 瓶の口がずれないように合わせた状態で、バイアルが上にな...
+ そのまま数十秒置き、ハエが動かなくなっているのを確認後(...
+ 雄雌の違いを見つけ、スケッチまたは言葉で表現する。
#br
|CENTER:&ref(fig4a.jpg);&aname(fig4);|CENTER:&ref(fig4b.j...
|>|>|CENTER:''図4.ショウジョウバエの取扱い方''|
#br
*** ポイントやトラブルシューティング [#ge4b3987]
- &aname(attention1);[[注1>#attention1r]]:ジエチルエー...
- &aname(attention2);[[注2>#attention2r]]:この操作で、...
- &aname(attention3);[[注3>#attention3r]]:ピンセットは...
#br
** アルコール脱水素酵素活性測定による表現型の判定 [#ye8b8...
***材料 [#t073e9e8]
-''ショウジョウバエ('''Drosophila melanogaster''')野生...
***試薬 [#vd3fb8d2]
詳細や調整については、『試薬の調整法』参照
-''ジエチルエーテル''
-''[[アルコール脱水素酵素活性測定のための発色用混合液>#al...
***器具 [#ca5fd1f5]
-''ハエ麻酔用具''&br;麻酔瓶(ジエチルエーテル入り)&br;白...
-''爪楊枝''(5本/人):ハエを潰すのに用いる。
-''マルチウェルストリップ''(1枚/2人):酵素活性を判定す...
-''30℃インキュベーター''
-''[[マイクロピペッター>生物学実験/マイクロピペッターの使...
***手順 [#e4534e3b]
+ 麻酔したハエを空のマルチウェルストリップの1穴に1匹入れ...
+ 雑種第1代および雑種第2代の表現型を調べる場合は、どの...
+ 潰したハエの入っているすべての穴に発色用混合液(アルコ...
+ インキュベーターに入れたマルチウェルストリップを取り出...
#br
|CENTER:&ref(fig5a.jpg);&aname(fig5);|CENTER:&ref(fig5b.j...
|>|CENTER:''図5. アルコール脱水素酵素活性の測定''|
|>|CENTER:左:サンプルの調整、右:活性のあるものは、青色...
#br
CENTER:''表1 ショウジョウバエ雑種第1代の表現型''&aname...
|BGCOLOR(#c0504d):COLOR(white):CENTER: 活性&nb...
|CENTER:有り|||||||||
|CENTER:なし|||||||||
#br
CENTER:''表2 ショウジョウバエ雑種第2代の表現型''&aname...
|BGCOLOR(#c0504d):COLOR(white):CENTER: 活性&nb...
|CENTER:有り|||||||||
|CENTER:なし|||||||||
#br
*** ポイントやトラブルシューティング [#z3503269]
- &aname(attention4);[[注4>#attention4r]]:爪楊枝は、必...
- &aname(attention5);[[注5>#attention5r]]:マルチウェル...
- &aname(attention6);[[注6>#attention6r]]:発色の待ち時...
- &aname(attention7);[[注7>#attention7r]]:発色の状態は...
#br
**PCR法による遺伝子型の判定 [#c8d932cf]
***材料 [#sd5050bc]
-''ショウジョウバエ('''Drosophila melanogaster''')野生...
***試薬 [#f94d6798]
詳細や調整については、『試薬の調整法』参照
-''[[キレックス溶液>#Lch]]''
-''[[中和液>#Lnu]]''
-''[[PCR反応液>#Lpc]]''
-''1%アガロースゲル'':電気泳動ゲル
-''[[TAEバッファー>#Lta]]'':電気泳動時に泳動槽を満たす溶...
-''[[ローディングバッファー>#Lbu]]''
-''[[サイズマーカー>#Lsi]]''
-''[[エチジウムブロマイド溶液>#Let]]''
***器具 [#a0a67375]
-''ハエ麻酔用具&br;''麻酔瓶(ジエチルエーテル入り)&br;白...
-''エッペンチューブ''(2本/人)
-''爪楊枝''(5本/人)
-''[[マイクロピペッター>生物学実験/マイクロピペッターの使...
-''フローティングフォーム''
-''沸騰槽''
-''冷却槽(氷入りバケツ)''
-''高速遠心分離機''
-''サーマルサイクラー''
-''電気泳動装置(観察・撮影装置)''
***手順 [#oca1cf10]
+''DNAの抽出''
++ 1.5ml エッペンチューブにハエを1個体入れて、できるだけ...
++ キレックス溶液の入った試験管のふたをしっかり閉め、よく...
++エッペンチューブは、しっかり蓋をして、フローティングフ...
++ 煮沸後、チューブを取り出して氷上で3分程度保冷する。
++ P1000のマイクロピペッターを使って、中和液350µlを...
++高速遠心分離機にチューブをセットし、12000rpmで5分間遠...
++ 遠心が終わったら、沈殿を崩さないよう静かにチューブを取...
++上清には、ハエのゲノムDNAが含まれている(DNA抽出液)の...
#br
|CENTER:&ref(fig6a.jpg);&aname(fig6);|CENTER:&ref(fig6b.j...
|>|CENTER:''図6. DNAの抽出''|
|>|CENTER:左:サンプルの調整、右:フローティングフォーム...
#br
+''PCRによるDNA増殖''
++氷冷した反応用エッペンチューブにP200のマイクロピペッタ...
++反応チューブに、先に用意したDNA抽出液をP20のマイクロピ...
++チューブのふたを閉めて、サンプル名を表記の上、氷に刺し...
++サンプルをサーマルサイクラーにかけ、DNAを増幅させる([[...
#br
|CENTER:&ref(fig7.jpg);&aname(fig7);|
|CENTER:''図7.サーマルサイクラー''|
#br
+''電気泳動''
++電気泳動槽に1%アガロースゲルとTAEバッファーを入れ準備...
++サーマルサイクラーにかけたエッペンチューブに、P20のマイ...
++電気泳動槽のアガロースゲル左端のウェル(窪み)に、サイ...
++ウェルにii)で用意したサンプル溶液10µlを静かに入れ...
++ふたをして、100Vで20〜30分 電気泳動する([[注13...
++通電を止めて泳動を終了する。
++ゲルを壊さないよう、枠ごと泳動槽から取り出し、ゲルのみ...
++ゲルを取り出して、観察装置において紫外線除去フィルター...
#br
|CENTER:&ref(fig8a.jpg);&aname(fig8);|CENTER:&ref(fig8b.j...
|>|CENTER:''図8. 電気泳動''|
|>|CENTER:左:左:電気泳動槽とサンプルの入れかた、右:ゲ...
#br
CENTER:表3 ショウジョウバエ雑種第2代の遺伝子型
|BGCOLOR(#c0504d):COLOR(white):CENTER: 遺伝子...
|CENTER:'''Adh&super{+};'''/'''Adh&super{+};'''|||||||||
|CENTER:'''Adh&super{+};'''/'''Adh&super{fn6};''' |||||||||
|CENTER:'''Adh&super{fn6};'''/'''Adh&super{fn6};'''||||||...
#br
*** ポイントやトラブルシューティング [#c10b96ae]
- &aname(attention8);[[注8>#attention8r]]:エッペンチュ...
- &aname(attention9);[[注9>#attention9r]]:DNA抽出液は、...
- &aname(attention10);[[注10>#attention10r]]:PCR反応に...
- &aname(attention11);[[注11>#attention11r]]:ウェルに...
- &aname(attention12);[[注12>#attention12r]]:ウェルに...
- &aname(attention13);[[注13>#attention13r]]:ローディ...
- &aname(attention14);[[注14>#attention14r]]:エチジウ...
- &aname(attention15);[[注15>#attention15r]]:紫外線ラ...
** 実験を成功させるための留意点 [#t4bed428]
'' 実験前''
- 実験のスケジュールに合わせて、処女雌を確保し、雑種第1...
- 電気泳動槽は、実験のスケジュールによっては、あらかじめ...
'' 実験中''
- [[マイクロピペッター>生物学実験/マイクロピペッターの使...
'' 実験後''
- エチジウムブロマイド溶液の廃液は十分に注意して回収する...
** 本実験の発展 [#oa5ffc5c]
- 『唾線染色体の観察』や『集団遺伝実験』とも組み合わせ、...
**資料 [#ndbc9e76]
***材料の準備 [#p5c3aab2]
-''ショウジョウバエ('''Drosophila melanogaster''')の野...
#105669 Oregon-R-C
#106615 Adh[fn6] cn[1]; ry[506]
-''飼育法'':川崎陽久ら(2007)に詳細に記載、下記URL参照&br...
#br
+下記の手順によって雑種第1代(F&subsc{1};)および雑種第...
++ 羽化後8時間以内のハエに麻酔をかけ、雄雌を分ける。
++ 野生型♀とアルコール脱水素酵素変異体♂(または、野生型♂...
++ 1週間25℃で飼育すると、産卵が行われ、幼虫が現れるので、...
++ 雑種第1代の♂と♀を数匹ずつを新しい培地の入ったバイアル...
***試薬の調整法 [#y008a9ec]
-''アルコール脱水素酵素活性測定のための発色用混合液''&ana...
|CENTER:BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(white):アルコール脱水素酵...
|CENTER:[[0.2M リン酸バッファー pH7.4>#PH]]|RIGHT:9ml|
|CENTER:[[NBT 5mg/ml>#NB]]|RIGHT:9ml|
|CENTER:[[NAD 50mg/ml>#NA]]|RIGHT:1.8ml|
|CENTER:2-ブタノール|RIGHT:1.8ml|
|CENTER:[[PMS 2mg/ml>#PM]]|RIGHT:0.9ml|
|CENTER:蒸留水|RIGHT:27ml|
#br
|BGCOLOR(lightblue):CENTER:&aname(PH);0.2M リン酸バッファ...
|CENTER:0.2M NaHPO&subsc{4};|RIGHT:38.7ml|
|CENTER:0.2M NaH&subsc{2};PO&subsc{4};|RIGHT: 11.3ml|
#br
|BGCOLOR(lightblue):CENTER:&aname(NB);NBT 5mg/ml|BGCOLOR(...
|CENTER:p-Nitroblue Tetrazolium Chloride|RIGHT:45mg|
|CENTER:70% dimethyl formamide|RIGHT:9ml|
#br
|BGCOLOR(lightblue):CENTER:&aname(NA);NAD 50mg/ml|BGCOLOR...
|CENTER:β-Nicotinamide-adenin dinucleotide (oxidizend for...
|CENTER:蒸留水|RIGHT:2ml|
#br
|BGCOLOR(lightblue):CENTER:&aname(PM);PMS 2mg/ml|BGCOLOR...
|CENTER:Phenazine methosulfate|RIGHT:2mg|
|CENTER:蒸留水|RIGHT:1ml|
#br
-''キレックス溶液'' (10% Chelex®-100、50mM Tris-HCl...
|CENTER:BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(white):キレックス溶液|BGCO...
|CENTER:[[1M Tris (pH 7.5)>#TR]]|RIGHT:12.5ml|
|CENTER:蒸留水|RIGHT:約180ml|
|CENTER:Chelex®-100 (10%)|RIGHT:25g|
|CENTER:NaOH|RIGHT:pH11になるように滴下|
|>|CENTER:蒸留水で250mlにメスアップ|
#br
-''中和液''(167mM Tris-HCl pH 7.5 )&aname(Lnu);
|CENTER:BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(white):中和液|BGCOLOR(#4f8...
|CENTER:[[1M Tris (pH 7.5)>#TR]]|RIGHT:41.75ml|
|>|CENTER:蒸留水で250mlにメスアップ|
#br
|BGCOLOR(lightblue):CENTER:&aname(TR);1M Tris (pH 7.5)溶...
|CENTER:Tris|RIGHT:30.3g|
|CENTER:蒸留水|RIGHT:約200ml|
|CENTER:HCl|RIGHT: pH7.5になるように滴下|
|>|CENTER:蒸留水で250mlにメスアップ|
#br
-''PCR反応液'' (1反応分の組成)&aname(Lpc);
|CENTER:BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(white):PCR反応液|BGCOLOR(#...
|CENTER:PCR Master Mix(2x) Promega社 #M7502|RIGHT:25&mic...
|CENTER:100 pmol/µl Primer L1F (TTCCTCTTGGAAAATCACC...
|CENTER:100 pmol/µl Primer L1R (GTGGGCATCGCATAGTTAC...
|CENTER:100 pmol/µl Primer MutF (GCGATCTGAAGGCGATCT...
|CENTER:100 pmol/µl Primer MutR (CCGTTGATCAGGACATCG...
|CENTER:DDW(滅菌蒸留水)|RIGHT:19.7µl|
#br
-''ローディングバッファー'' (0.25% xylene cyanol FF, 1mM ...
|CENTER:BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(white):ローディングバッフ...
|CENTER:1% xylene cyanol FF|RIGHT:12.5ml|
|CENTER:[[500mM EDTA>#ED]]|RIGHT:0.1ml|
|CENTER:Glycerol|RIGHT:15ml|
|>|CENTER:蒸留水で50mlにメスアップ|
#br
-&aname(Let);''エチジウムブロマイド溶液'':10 mg/ml のス...
|CENTER:BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(white):エチジウムブロマイ...
|CENTER:ethidium bromide (EtBr)|RIGHT:1g|
|CENTER:蒸留水|RIGHT:100ml|
#br
-''TAEバッファー'': 電気泳動時に泳動槽を満たす溶液&aname(...
50倍濃度(50 x TAE: 2M Tris, 2M 酢酸, 0.05M EDTA)を作成...
|CENTER:BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(white):50×TAEバッファー|BG...
|CENTER:Tris|RIGHT:60.5g|
|CENTER:氷酢酸|RIGHT:14.3ml|
|CENTER:[[500mM EDTA>#ED]]|RIGHT:25ml|
|>|CENTER:蒸留水で250mlにメスアップ|
#br
|BGCOLOR(lightblue):CENTER:&aname(ED);500mM EDTA|BGCOLOR(...
|CENTER:ethylene-diamine-tetra-acetic acid ・2Na ・2H&subsc...
|CENTER:NaOH (粒状)|RIGHT:約5g|
|CENTER:5N NaOH|RIGHT:pHを8になるように滴下|
|>|CENTER:蒸留水で250mlにメスアップ|
#br
-''サイズマーカー'': invitogen 100bp DNA ラダー&aname(Lsi);
*** 参考文献 [#qc8f9b51]
- 川崎陽久ら(2007) 学生実験用教材としてのショウジョウバ...
- 小野裕剛ら(2008) リベラルアーツとしての統合的遺伝学・...
- Brogna S, Ashburner M (1997) The Adh-related gene of Dr...
*** 用語解説 [#v301fa3f]
:&aname(term1);[[PCR法>#term1r]]|PCR(Polymerase Chain Rea...
:&aname(term2);[[オルソロガス遺伝子>#term2r]]|「相同な遺...
:&aname(term3);[[補酵素>#term3r]]|酵素が働く際に、基質や...
:&aname(term4);[[ゲノム(ゲノムDNA)>#term4r]]|一つの生物種...
:&aname(term5);[[プライマー>#term5r]]|DNAを合成する酵素「...
*** 印刷用PDFマニュアル [#uf063778]
&ref(ショウジョウバエ.pdf);
終了行:
* ショウジョウバエによる統合的遺伝学実験 [#he345cef]
RIGHT:SIZE(9){画像をクリックすると拡大表示されます。}
#ref(生物学実験/タイトル画/Tショウジョウバエ.jpg,exif,rig...
#contents
作成中
** 実験のねらいと特徴 [#g72cf6ee]
遺伝の学習で重要な「遺伝子発現」と「遺伝の法則」を、同時...
ライフサイクルが比較的短いショウジョウバエを使って、メン...
*** 実験の流れ [#bcdd38a7]
+ 準備
++ ショウジョウバエ 雑種第1代(F&subsc{1};)、第2代(F...
++ 材料、試薬、器具の準備
+ 前説明
++ メンデル遺伝の法則
++ ショウジョウバエの取扱い方
++ アルコール脱水素酵素と測定法について
++ DNAの抽出法とPCR法について
++ 電気泳動の方法ついて
+ 実験中
++ ショウジョウバエの形態観察
++ 酵素活性の測定による表現型の判定
++ DNA抽出
++ PCR法によるDNA増幅
++ 電気泳動による遺伝子型の判定
+ 実験後
++ レポート作成と提出
++ 片付け
** はじめに [#c5bef753]
ショウジョウバエは飼育が容易で世代時間が短く、多くの...
この実験では、ショウジョウバエにもヒトにも存在するアルコ...
#br
|CENTER:&ref(ADH.jpg);&aname(fig1);|
|CENTER:''図1.アルコール脱水素酵素(ADH)の反応''|
|LEFT:NAD&super{+ };:ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド...
#br
野生のショウジョウバエは、酵母を栄養源としているので...
#br
|CENTER:&ref(ゲノム配列.jpg);&aname(fig2);|
|CENTER:''図2.ショウジョウバエ'''Adh'''遺伝子多型検出の...
#br
一方、遺伝子型の判定は、ADH活性の有無だけではわからな...
PCR法はサンプルから抽出したDNA(今回はショウジョウバエゲ...
#br
|CENTER:&ref(fig-1.jpg);&aname(fig3);|
|CENTER:''図3.ショウジョウバエ'''Adh'''遺伝子多型検出の...
|CENTER:プライマー(1)、(4)は野生型、変異型で共通。|
#br
** 目的と課題 [#r71b38d9]
- ''(目的1)''酵素活性の有無を測定し、交配で得た雑種第...
-- ''課題1'':ショウジョウバエの雄雌の違いを観察し、スケ...
-- ''課題2'':アルコール脱水素酵素の活性を測定し、結果を...
- ''(目的2)''PCR法で増幅した1個体のDNAを電気泳動するこ...
-- ''課題3'':1個体からDNAを抽出し、PCRにかける。
-- ''課題4'':増幅したDNAサンプルを電気泳動にかけ、バン...
** ショウジョウバエの形態の観察 [#vb5fdad6]
***材料[#cabcdfdb]
-''ショウジョウバエ('''Drosophila melanogaster''')'':...
***試薬[#rb45b5c3]
-''ジエチルエーテル''
***器具[#m65ed5ac]
-''ルーペまたは[[実体顕微鏡>生物学実験/実体顕微鏡の使い方...
-''麻酔瓶''(ジエチルエーテル入り)
-''白色タイル'':観察・作業台
-''竹ひご または平筆'':ハエを扱うのに用いる
-''マウスパッド'':ハエを瓶の底に集めるときに用いる。
***手順 [#qe9a41ca]
+ 麻酔瓶にジエチルエーテルを2〜3滴スポイトで垂らす([[注...
+ ハエの入ったバイアルをマウスパッドの上などで、軽く叩い...
+ ハエが落ちたことを確認後、バイアルの蓋をあけ、麻酔瓶の...
+ 瓶の口がずれないように合わせた状態で、バイアルが上にな...
+ そのまま数十秒置き、ハエが動かなくなっているのを確認後(...
+ 雄雌の違いを見つけ、スケッチまたは言葉で表現する。
#br
|CENTER:&ref(fig4a.jpg);&aname(fig4);|CENTER:&ref(fig4b.j...
|>|>|CENTER:''図4.ショウジョウバエの取扱い方''|
#br
*** ポイントやトラブルシューティング [#ge4b3987]
- &aname(attention1);[[注1>#attention1r]]:ジエチルエー...
- &aname(attention2);[[注2>#attention2r]]:この操作で、...
- &aname(attention3);[[注3>#attention3r]]:ピンセットは...
#br
** アルコール脱水素酵素活性測定による表現型の判定 [#ye8b8...
***材料 [#t073e9e8]
-''ショウジョウバエ('''Drosophila melanogaster''')野生...
***試薬 [#vd3fb8d2]
詳細や調整については、『試薬の調整法』参照
-''ジエチルエーテル''
-''[[アルコール脱水素酵素活性測定のための発色用混合液>#al...
***器具 [#ca5fd1f5]
-''ハエ麻酔用具''&br;麻酔瓶(ジエチルエーテル入り)&br;白...
-''爪楊枝''(5本/人):ハエを潰すのに用いる。
-''マルチウェルストリップ''(1枚/2人):酵素活性を判定す...
-''30℃インキュベーター''
-''[[マイクロピペッター>生物学実験/マイクロピペッターの使...
***手順 [#e4534e3b]
+ 麻酔したハエを空のマルチウェルストリップの1穴に1匹入れ...
+ 雑種第1代および雑種第2代の表現型を調べる場合は、どの...
+ 潰したハエの入っているすべての穴に発色用混合液(アルコ...
+ インキュベーターに入れたマルチウェルストリップを取り出...
#br
|CENTER:&ref(fig5a.jpg);&aname(fig5);|CENTER:&ref(fig5b.j...
|>|CENTER:''図5. アルコール脱水素酵素活性の測定''|
|>|CENTER:左:サンプルの調整、右:活性のあるものは、青色...
#br
CENTER:''表1 ショウジョウバエ雑種第1代の表現型''&aname...
|BGCOLOR(#c0504d):COLOR(white):CENTER: 活性&nb...
|CENTER:有り|||||||||
|CENTER:なし|||||||||
#br
CENTER:''表2 ショウジョウバエ雑種第2代の表現型''&aname...
|BGCOLOR(#c0504d):COLOR(white):CENTER: 活性&nb...
|CENTER:有り|||||||||
|CENTER:なし|||||||||
#br
*** ポイントやトラブルシューティング [#z3503269]
- &aname(attention4);[[注4>#attention4r]]:爪楊枝は、必...
- &aname(attention5);[[注5>#attention5r]]:マルチウェル...
- &aname(attention6);[[注6>#attention6r]]:発色の待ち時...
- &aname(attention7);[[注7>#attention7r]]:発色の状態は...
#br
**PCR法による遺伝子型の判定 [#c8d932cf]
***材料 [#sd5050bc]
-''ショウジョウバエ('''Drosophila melanogaster''')野生...
***試薬 [#f94d6798]
詳細や調整については、『試薬の調整法』参照
-''[[キレックス溶液>#Lch]]''
-''[[中和液>#Lnu]]''
-''[[PCR反応液>#Lpc]]''
-''1%アガロースゲル'':電気泳動ゲル
-''[[TAEバッファー>#Lta]]'':電気泳動時に泳動槽を満たす溶...
-''[[ローディングバッファー>#Lbu]]''
-''[[サイズマーカー>#Lsi]]''
-''[[エチジウムブロマイド溶液>#Let]]''
***器具 [#a0a67375]
-''ハエ麻酔用具&br;''麻酔瓶(ジエチルエーテル入り)&br;白...
-''エッペンチューブ''(2本/人)
-''爪楊枝''(5本/人)
-''[[マイクロピペッター>生物学実験/マイクロピペッターの使...
-''フローティングフォーム''
-''沸騰槽''
-''冷却槽(氷入りバケツ)''
-''高速遠心分離機''
-''サーマルサイクラー''
-''電気泳動装置(観察・撮影装置)''
***手順 [#oca1cf10]
+''DNAの抽出''
++ 1.5ml エッペンチューブにハエを1個体入れて、できるだけ...
++ キレックス溶液の入った試験管のふたをしっかり閉め、よく...
++エッペンチューブは、しっかり蓋をして、フローティングフ...
++ 煮沸後、チューブを取り出して氷上で3分程度保冷する。
++ P1000のマイクロピペッターを使って、中和液350µlを...
++高速遠心分離機にチューブをセットし、12000rpmで5分間遠...
++ 遠心が終わったら、沈殿を崩さないよう静かにチューブを取...
++上清には、ハエのゲノムDNAが含まれている(DNA抽出液)の...
#br
|CENTER:&ref(fig6a.jpg);&aname(fig6);|CENTER:&ref(fig6b.j...
|>|CENTER:''図6. DNAの抽出''|
|>|CENTER:左:サンプルの調整、右:フローティングフォーム...
#br
+''PCRによるDNA増殖''
++氷冷した反応用エッペンチューブにP200のマイクロピペッタ...
++反応チューブに、先に用意したDNA抽出液をP20のマイクロピ...
++チューブのふたを閉めて、サンプル名を表記の上、氷に刺し...
++サンプルをサーマルサイクラーにかけ、DNAを増幅させる([[...
#br
|CENTER:&ref(fig7.jpg);&aname(fig7);|
|CENTER:''図7.サーマルサイクラー''|
#br
+''電気泳動''
++電気泳動槽に1%アガロースゲルとTAEバッファーを入れ準備...
++サーマルサイクラーにかけたエッペンチューブに、P20のマイ...
++電気泳動槽のアガロースゲル左端のウェル(窪み)に、サイ...
++ウェルにii)で用意したサンプル溶液10µlを静かに入れ...
++ふたをして、100Vで20〜30分 電気泳動する([[注13...
++通電を止めて泳動を終了する。
++ゲルを壊さないよう、枠ごと泳動槽から取り出し、ゲルのみ...
++ゲルを取り出して、観察装置において紫外線除去フィルター...
#br
|CENTER:&ref(fig8a.jpg);&aname(fig8);|CENTER:&ref(fig8b.j...
|>|CENTER:''図8. 電気泳動''|
|>|CENTER:左:左:電気泳動槽とサンプルの入れかた、右:ゲ...
#br
CENTER:表3 ショウジョウバエ雑種第2代の遺伝子型
|BGCOLOR(#c0504d):COLOR(white):CENTER: 遺伝子...
|CENTER:'''Adh&super{+};'''/'''Adh&super{+};'''|||||||||
|CENTER:'''Adh&super{+};'''/'''Adh&super{fn6};''' |||||||||
|CENTER:'''Adh&super{fn6};'''/'''Adh&super{fn6};'''||||||...
#br
*** ポイントやトラブルシューティング [#c10b96ae]
- &aname(attention8);[[注8>#attention8r]]:エッペンチュ...
- &aname(attention9);[[注9>#attention9r]]:DNA抽出液は、...
- &aname(attention10);[[注10>#attention10r]]:PCR反応に...
- &aname(attention11);[[注11>#attention11r]]:ウェルに...
- &aname(attention12);[[注12>#attention12r]]:ウェルに...
- &aname(attention13);[[注13>#attention13r]]:ローディ...
- &aname(attention14);[[注14>#attention14r]]:エチジウ...
- &aname(attention15);[[注15>#attention15r]]:紫外線ラ...
** 実験を成功させるための留意点 [#t4bed428]
'' 実験前''
- 実験のスケジュールに合わせて、処女雌を確保し、雑種第1...
- 電気泳動槽は、実験のスケジュールによっては、あらかじめ...
'' 実験中''
- [[マイクロピペッター>生物学実験/マイクロピペッターの使...
'' 実験後''
- エチジウムブロマイド溶液の廃液は十分に注意して回収する...
** 本実験の発展 [#oa5ffc5c]
- 『唾線染色体の観察』や『集団遺伝実験』とも組み合わせ、...
**資料 [#ndbc9e76]
***材料の準備 [#p5c3aab2]
-''ショウジョウバエ('''Drosophila melanogaster''')の野...
#105669 Oregon-R-C
#106615 Adh[fn6] cn[1]; ry[506]
-''飼育法'':川崎陽久ら(2007)に詳細に記載、下記URL参照&br...
#br
+下記の手順によって雑種第1代(F&subsc{1};)および雑種第...
++ 羽化後8時間以内のハエに麻酔をかけ、雄雌を分ける。
++ 野生型♀とアルコール脱水素酵素変異体♂(または、野生型♂...
++ 1週間25℃で飼育すると、産卵が行われ、幼虫が現れるので、...
++ 雑種第1代の♂と♀を数匹ずつを新しい培地の入ったバイアル...
***試薬の調整法 [#y008a9ec]
-''アルコール脱水素酵素活性測定のための発色用混合液''&ana...
|CENTER:BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(white):アルコール脱水素酵...
|CENTER:[[0.2M リン酸バッファー pH7.4>#PH]]|RIGHT:9ml|
|CENTER:[[NBT 5mg/ml>#NB]]|RIGHT:9ml|
|CENTER:[[NAD 50mg/ml>#NA]]|RIGHT:1.8ml|
|CENTER:2-ブタノール|RIGHT:1.8ml|
|CENTER:[[PMS 2mg/ml>#PM]]|RIGHT:0.9ml|
|CENTER:蒸留水|RIGHT:27ml|
#br
|BGCOLOR(lightblue):CENTER:&aname(PH);0.2M リン酸バッファ...
|CENTER:0.2M NaHPO&subsc{4};|RIGHT:38.7ml|
|CENTER:0.2M NaH&subsc{2};PO&subsc{4};|RIGHT: 11.3ml|
#br
|BGCOLOR(lightblue):CENTER:&aname(NB);NBT 5mg/ml|BGCOLOR(...
|CENTER:p-Nitroblue Tetrazolium Chloride|RIGHT:45mg|
|CENTER:70% dimethyl formamide|RIGHT:9ml|
#br
|BGCOLOR(lightblue):CENTER:&aname(NA);NAD 50mg/ml|BGCOLOR...
|CENTER:β-Nicotinamide-adenin dinucleotide (oxidizend for...
|CENTER:蒸留水|RIGHT:2ml|
#br
|BGCOLOR(lightblue):CENTER:&aname(PM);PMS 2mg/ml|BGCOLOR...
|CENTER:Phenazine methosulfate|RIGHT:2mg|
|CENTER:蒸留水|RIGHT:1ml|
#br
-''キレックス溶液'' (10% Chelex®-100、50mM Tris-HCl...
|CENTER:BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(white):キレックス溶液|BGCO...
|CENTER:[[1M Tris (pH 7.5)>#TR]]|RIGHT:12.5ml|
|CENTER:蒸留水|RIGHT:約180ml|
|CENTER:Chelex®-100 (10%)|RIGHT:25g|
|CENTER:NaOH|RIGHT:pH11になるように滴下|
|>|CENTER:蒸留水で250mlにメスアップ|
#br
-''中和液''(167mM Tris-HCl pH 7.5 )&aname(Lnu);
|CENTER:BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(white):中和液|BGCOLOR(#4f8...
|CENTER:[[1M Tris (pH 7.5)>#TR]]|RIGHT:41.75ml|
|>|CENTER:蒸留水で250mlにメスアップ|
#br
|BGCOLOR(lightblue):CENTER:&aname(TR);1M Tris (pH 7.5)溶...
|CENTER:Tris|RIGHT:30.3g|
|CENTER:蒸留水|RIGHT:約200ml|
|CENTER:HCl|RIGHT: pH7.5になるように滴下|
|>|CENTER:蒸留水で250mlにメスアップ|
#br
-''PCR反応液'' (1反応分の組成)&aname(Lpc);
|CENTER:BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(white):PCR反応液|BGCOLOR(#...
|CENTER:PCR Master Mix(2x) Promega社 #M7502|RIGHT:25&mic...
|CENTER:100 pmol/µl Primer L1F (TTCCTCTTGGAAAATCACC...
|CENTER:100 pmol/µl Primer L1R (GTGGGCATCGCATAGTTAC...
|CENTER:100 pmol/µl Primer MutF (GCGATCTGAAGGCGATCT...
|CENTER:100 pmol/µl Primer MutR (CCGTTGATCAGGACATCG...
|CENTER:DDW(滅菌蒸留水)|RIGHT:19.7µl|
#br
-''ローディングバッファー'' (0.25% xylene cyanol FF, 1mM ...
|CENTER:BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(white):ローディングバッフ...
|CENTER:1% xylene cyanol FF|RIGHT:12.5ml|
|CENTER:[[500mM EDTA>#ED]]|RIGHT:0.1ml|
|CENTER:Glycerol|RIGHT:15ml|
|>|CENTER:蒸留水で50mlにメスアップ|
#br
-&aname(Let);''エチジウムブロマイド溶液'':10 mg/ml のス...
|CENTER:BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(white):エチジウムブロマイ...
|CENTER:ethidium bromide (EtBr)|RIGHT:1g|
|CENTER:蒸留水|RIGHT:100ml|
#br
-''TAEバッファー'': 電気泳動時に泳動槽を満たす溶液&aname(...
50倍濃度(50 x TAE: 2M Tris, 2M 酢酸, 0.05M EDTA)を作成...
|CENTER:BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(white):50×TAEバッファー|BG...
|CENTER:Tris|RIGHT:60.5g|
|CENTER:氷酢酸|RIGHT:14.3ml|
|CENTER:[[500mM EDTA>#ED]]|RIGHT:25ml|
|>|CENTER:蒸留水で250mlにメスアップ|
#br
|BGCOLOR(lightblue):CENTER:&aname(ED);500mM EDTA|BGCOLOR(...
|CENTER:ethylene-diamine-tetra-acetic acid ・2Na ・2H&subsc...
|CENTER:NaOH (粒状)|RIGHT:約5g|
|CENTER:5N NaOH|RIGHT:pHを8になるように滴下|
|>|CENTER:蒸留水で250mlにメスアップ|
#br
-''サイズマーカー'': invitogen 100bp DNA ラダー&aname(Lsi);
*** 参考文献 [#qc8f9b51]
- 川崎陽久ら(2007) 学生実験用教材としてのショウジョウバ...
- 小野裕剛ら(2008) リベラルアーツとしての統合的遺伝学・...
- Brogna S, Ashburner M (1997) The Adh-related gene of Dr...
*** 用語解説 [#v301fa3f]
:&aname(term1);[[PCR法>#term1r]]|PCR(Polymerase Chain Rea...
:&aname(term2);[[オルソロガス遺伝子>#term2r]]|「相同な遺...
:&aname(term3);[[補酵素>#term3r]]|酵素が働く際に、基質や...
:&aname(term4);[[ゲノム(ゲノムDNA)>#term4r]]|一つの生物種...
:&aname(term5);[[プライマー>#term5r]]|DNAを合成する酵素「...
*** 印刷用PDFマニュアル [#uf063778]
&ref(ショウジョウバエ.pdf);
ページ名: