慶應義塾大学日吉キャンパス 特色GP 文系学生への実験を重視した自然科学教育
生物学実験/マイタケのタンパク質分解酵素
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* マイタケのタンパク質分解酵素 [#e93cebf4]
RIGHT:SIZE(9){画像をクリックすると拡大表示されます。}
#ref(生物学実験/タイトル画/Tマイタケ.JPG,exif,right,wrap,...
#contents
** 実験のねらいと特徴 [#j4839f65]
菌類([[用語1>#term1]]&aname(term1r);)は生態系の中で分解...
*** 実験の流れ [#cd31870a]
+ 準備
++ マイタケ抽出液の作成
++ [[材料>#mate]]、[[試薬>#chem]]、[[器具>#inst]]の準備
+ 前説明
++ 生態系における菌類について
++ タンパク質分解酵素について
++ タンパク質の定量方法について
++ 分光光度計の使い方と吸光度について
+ 実験中
++ マイタケ入り茶碗蒸しの準備
++ タンパク質濃度と吸光度の検量線作成
++ マイタケ抽出液によるタンパク質の分解と定量
++ マイタケ入り茶碗蒸しの作成
+ 実験後
++ レポート作成と提出
++ 片付け
** はじめに [#t9de2fa9]
生物は、生態系内での働きに応じて、「生産者」「消費者」「...
|CENTER:&ref(炭素循環.jpg);&aname(fig1);|
|CENTER:''図1.生態系における物質循環の例''|
|CENTER:ここでは、炭素循環の主経路を示す。分解者は生態系...
#br
タンパク質は20種類のアミノ酸が、数十個〜数千個に渡...
|CENTER:&ref(プロテアーゼ.jpg);&aname(fig2);|
|CENTER:''図2.タンパク質とプロテアーゼ''|
|LEFT:プロテアーゼは、作用部位により2種類のペプチダーゼと...
#br
今回の実験ではマイタケの子実体を用いて、タンパク質分解活...
** 目的と課題 [#z2a1d6d0]
- ''(目的1)''タンパク質濃度と吸光度(O.D)の検量線を作成...
-- ''課題1'':横軸にタンパク質濃度、縦軸に吸光度(O.D)を...
- ''(目的2)''実験溶液の吸光度から各溶液中のタンパク質...
-- ''課題2'':実験溶液の吸光度から課題1で作成した検量線...
- ''(目的3)''マイタケ抽出液中のタンパク質分解酵素につ...
-- ''課題3'':横軸に反応時間、縦軸にタンパク質濃度を取っ...
-- ''課題4'':マイタケ入り茶碗蒸しの結果と課題3のグラフ...
** 実験 [#tcc18bd0]
***材料&aname(mate); [#hce84ff8]
-''マイタケ('''Grifola frondosa''')''
***試薬&aname(chem); [#ma8d726a]
試薬の調整は、資料の[[試薬調整法>#cb32ab58]] 参照
-''[[緩衝液>#med1]]'' (1ml /2人)
-''[[タンパク質溶液>#med2]]'' (615µl/2人)
-''[[タンパク質比色検定試薬>#med3]]''(3.2ml/2人)
-''[[卵液>#med4]]'' (100ml/2人)
-''[[マイタケ抽出液>#med5]]'' (600µl/2人)
***器具&aname(inst); [#y53ca30f]
-''マイクロチューブ'' 8本/2人
-''[[マイクロピペッター>生物学実験/マイクロピペッターの使...
-''16ウェルストリップ'' 1個/2人: 今回はハンドリング性能...
-''ビーカー'' 2個/2人: 茶碗蒸し作成に使用
-''50℃恒温水槽'' : 酵素反応に使用
-''蒸し器'' : 茶碗蒸し作成に使用
-''マイクロプレートリーダー''([[図3>#fig3]])([[用語5>#...
-''グラフ用紙''
-''ロート、濾紙、注射器つき滅菌フィルター'':マイタケ抽出...
#br
|CENTER:&ref(fig3.jpg);&aname(fig3);|
|CENTER:''図3.マイクロプレートリーダー''|
***手順 [#z3588fcb]
+ ''茶碗蒸し実験の準備''
++卵液50mlの入ったビーカー2個を用意し、一方にマイタケ断...
++マイタケを入れた時間を記録しておく。
|CENTER:&ref(fig4.jpg);&aname(fig4);|
|CENTER:''図4.茶碗蒸し実験の準備''|
|CENTER:左)対照 右)マイタケ入り|
#br
+''検量線のためのタンパク質溶液調整''
++マイクロチューブ5本にA-1〜A-5の記号をつける。
++A-1〜A-5のチューブに緩衝液をP20のマイクロピペッターで15...
++A-1のチューブにタンパク質溶液15µlを加え、マイクロ...
#br
CENTER:&aname(table1);''表1.検量線のためのタンパク質2倍...
|BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(White):CENTER:チューブNo.|BGCOLOR...
|タンパク質濃度(μg/ml)|RIGHT:720|RIGHT:360|RIGHT:180|RIGH...
#br
|CENTER:&ref(マイタケ希釈3.jpg);&aname(fig5);|
|CENTER:''図5.2倍希釈系列の作成法''|
#br
+''吸光度測定''
++16ウェルストリップのタブに切り込みがある側を左にして、...
++16のすべてのウェルに染色液をP1000のマイクロピペッタ...
++各ウェルに、入れる溶液を、[[表1>#table1]]、[[表2>#tab...
#br
|CENTER:&ref(fig6.jpg);&aname(fig6);|
|CENTER:''図6.16ウェルストリップと入れる溶液''|
#br
++マイクロチューブを3本用意してB-1からB-3の記号をつける。
#br
CENTER:&aname(table2);''表2.実験溶液の組み合わせ''
|BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(White):CENTER:チューブNo.|BGCOLOR...
|基質 300 µl|CENTER:タンパク溶質液|CENTER:緩衝液|C...
|酵素 300 µl|CENTER:マイタケ抽出液|CENTER:マイタケ...
#br
++基質として、B-1とB-3のチューブには、タンパク質溶液300&...
++B-1に酵素液として、マイタケ抽出液300µlを加えたら...
++B-2に酵素液として、マイタケ抽出液300µlを加えた...
++B-3は、酵素液のかわりに、緩衝液300µlを加えたら...
++A-1からA-5および緩衝液も10µlをとり、対応するウェ...
++最後の溶液をウェルに入れてから5分経過後、16ウェルストリ...
#br
|CENTER:&ref(fig7.jpg);&aname(fig7);|
|CENTER:''図7.反応後の16ウェルストリップ''|
#br
#br
|&ref(graph1.jpg);&aname(graph1);|
|CENTER:''グラフ1.タンパク質濃度と595nmの吸光度による検...
#br
CENTER:&aname(table3);''表3.タンパク質濃度と吸光度の関...
|BGCOLOR(#c0504d):COLOR(white):CENTER:タンパク質濃度&br;...
|CENTER:吸光度| ...
#br
CENTER:&aname(table4);''表4.B-1マイタケ抽出液によるタン...
|BGCOLOR(#c0504d):COLOR(white):CENTER:反応時間|BGCOLOR(#c...
|CENTER:吸光度| ...
|CENTER:タンパク質濃度(μg/ml)||||||
|CENTER:タンパク質濃度の変化量|CENTER:0|||||
#br
CENTER:&aname(table5);''表5.B-2、B-3 のタンパク質濃度...
|BGCOLOR(#c0504d):|>|BGCOLOR(#c0504d):COLOR(white):CENTER...
|BGCOLOR(#c0504d):COLOR(white):CENTER:反応時間|BGCOLOR(#c...
|CENTER:吸光度| ...
|CENTER:タンパク質濃度(μg/ml)|||||
|CENTER:タンパク質濃度の変化量|CENTER:0||CENTER:0||
#br
|&ref(graph2.jpg);&aname(graph2);|
|CENTER:''グラフ2.タンパク質濃度変化量と反応時間''|
#br
+''茶碗蒸しの作成''&br;
1.で準備した卵液を湯気の立った蒸し器に入れ、強火1分加熱...
#br
|CENTER:&ref(fig8.jpg);&aname(fig8);|
|CENTER:''図8.マイタケ入り茶碗蒸し'' &br;左)卵液のみ(...
*** ポイントやトラブルシューティング [#l10d0804]
- &aname(attention1);[[注1>#attention1r]]:検量線を描く...
- &aname(attention2);[[注2>#attention2r]]:基質と酵素液...
- &aname(attention3);[[注3>#attention3r]]:0分後B-1の溶...
- &aname(attention4);[[注4>#attention4r]]:計測器からで...
#br
*** 実験を成功させるための留意点 [#t0749802]
'' 実験前''
- マイタケ抽出液は、内在の余分なタンパク質を分解させるた...
'' 実験中''
- マイクロピペッターのチップは、溶液ごとに交換するように...
'' 実験後''
-タンパク質比色検定試薬は所定の廃液ビンに集め、流しなどに...
** 本実験の発展 [#m23ce232]
- 他の種類のキノコで同様の実験を行うことで、キノコの種類...
**資料 [#r99bc2ab]
***試薬調整法 ([[Flash Movie>#movie]]) [#cb32ab58]
-''緩衝液(PBS, pH7.0)&aname(med1);'' (1ml /2人):反応...
|BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(White):CENTER:10倍濃度PBS|BGCOLOR...
|KCl|RIGHT:0.2g|
|KH&subsc{2};PO&subsc{4};|RIGHT:0.2g|
|NaCl|RIGHT:8g|
|Na&subsc{2};HPO&subsc{4};・12H&subsc{2};O|RIGHT:2.9g|
|>|蒸留水で100mlにメスアップ|
#br
-''タンパク質溶液 (1440 µg/ml BSA ウシ血清アルブ...
BSAのグラムに合わせて、溶解させる蒸留水の量を濃度が1440 &...
#br
-''タンパク質比色検定試薬&aname(med3);'' (3.2ml/2人)...
タンパク質の定量にはBradford法を用いる。この方法はタンパ...
#br
-''卵液&aname(med4);'' (100ml/2人):
全卵をほぐし、3倍量の水道水(または、だし汁)で希釈し、茶...
#br
-''マイタケ抽出液&aname(med5);''(600µl/2人):
子実体100gを細かく刻み200 mlの緩衝液を加え、室温で約1時...
#br
&aname(movie);
#flash(マイタケ抽出液の作り方.swf,640x480,loop="true")
''図9.Flash Movieによるマイタケ抽出液の作り方''&br;
#br
''画面左下のアイコンについて''&br;
&ref(生物学実験/アイコン/右2.jpg,,70%);3秒間隔の自動で...
&ref(生物学実験/アイコン/停止.jpg,,70%);そのページで停止...
&ref(生物学実験/アイコン/右1.jpg,,70%);手動で次のページ...
&ref(生物学実験/アイコン/左.jpg,,70%);一つ前のページに戻...
RIGHT:再生には[[Adobe Flash Player>http://get.adobe.com/j...
#br
*** 参考文献 [#u3035811]
-[[文献1>#paper1r]]&aname(paper1);:大野信子、仁平佳奈、...
-[[文献2>#paper2r]]&aname(paper2);:農林水産省消費安全技...
(http://www.famic.go.jp/public_relations_magazine/kouhou...
*** 用語解説 [#ae8e1340]
:&aname(term1);[[菌類>#term1r]]|細胞壁を持ち、動物のよう...
:&aname(term2);[[分解者>#term2r]]|動植物の遺体や排泄物な...
:&aname(term3);[[菌糸>#term3r]]|キノコ(カビも同様である...
:&aname(term4);[[子実体>#term4r]]|キノコは胞子を効率よく...
:&aname(term5);[[マイクロプレートリーダー>#term5r]]|光源...
:&aname(term6);[[ウシ血清アルブミン(BSA)>#term6r]]|血清...
*** 印刷用PDFマニュアル [#w1196e7e]
&ref(マイタケ.pdf);
終了行:
* マイタケのタンパク質分解酵素 [#e93cebf4]
RIGHT:SIZE(9){画像をクリックすると拡大表示されます。}
#ref(生物学実験/タイトル画/Tマイタケ.JPG,exif,right,wrap,...
#contents
** 実験のねらいと特徴 [#j4839f65]
菌類([[用語1>#term1]]&aname(term1r);)は生態系の中で分解...
*** 実験の流れ [#cd31870a]
+ 準備
++ マイタケ抽出液の作成
++ [[材料>#mate]]、[[試薬>#chem]]、[[器具>#inst]]の準備
+ 前説明
++ 生態系における菌類について
++ タンパク質分解酵素について
++ タンパク質の定量方法について
++ 分光光度計の使い方と吸光度について
+ 実験中
++ マイタケ入り茶碗蒸しの準備
++ タンパク質濃度と吸光度の検量線作成
++ マイタケ抽出液によるタンパク質の分解と定量
++ マイタケ入り茶碗蒸しの作成
+ 実験後
++ レポート作成と提出
++ 片付け
** はじめに [#t9de2fa9]
生物は、生態系内での働きに応じて、「生産者」「消費者」「...
|CENTER:&ref(炭素循環.jpg);&aname(fig1);|
|CENTER:''図1.生態系における物質循環の例''|
|CENTER:ここでは、炭素循環の主経路を示す。分解者は生態系...
#br
タンパク質は20種類のアミノ酸が、数十個〜数千個に渡...
|CENTER:&ref(プロテアーゼ.jpg);&aname(fig2);|
|CENTER:''図2.タンパク質とプロテアーゼ''|
|LEFT:プロテアーゼは、作用部位により2種類のペプチダーゼと...
#br
今回の実験ではマイタケの子実体を用いて、タンパク質分解活...
** 目的と課題 [#z2a1d6d0]
- ''(目的1)''タンパク質濃度と吸光度(O.D)の検量線を作成...
-- ''課題1'':横軸にタンパク質濃度、縦軸に吸光度(O.D)を...
- ''(目的2)''実験溶液の吸光度から各溶液中のタンパク質...
-- ''課題2'':実験溶液の吸光度から課題1で作成した検量線...
- ''(目的3)''マイタケ抽出液中のタンパク質分解酵素につ...
-- ''課題3'':横軸に反応時間、縦軸にタンパク質濃度を取っ...
-- ''課題4'':マイタケ入り茶碗蒸しの結果と課題3のグラフ...
** 実験 [#tcc18bd0]
***材料&aname(mate); [#hce84ff8]
-''マイタケ('''Grifola frondosa''')''
***試薬&aname(chem); [#ma8d726a]
試薬の調整は、資料の[[試薬調整法>#cb32ab58]] 参照
-''[[緩衝液>#med1]]'' (1ml /2人)
-''[[タンパク質溶液>#med2]]'' (615µl/2人)
-''[[タンパク質比色検定試薬>#med3]]''(3.2ml/2人)
-''[[卵液>#med4]]'' (100ml/2人)
-''[[マイタケ抽出液>#med5]]'' (600µl/2人)
***器具&aname(inst); [#y53ca30f]
-''マイクロチューブ'' 8本/2人
-''[[マイクロピペッター>生物学実験/マイクロピペッターの使...
-''16ウェルストリップ'' 1個/2人: 今回はハンドリング性能...
-''ビーカー'' 2個/2人: 茶碗蒸し作成に使用
-''50℃恒温水槽'' : 酵素反応に使用
-''蒸し器'' : 茶碗蒸し作成に使用
-''マイクロプレートリーダー''([[図3>#fig3]])([[用語5>#...
-''グラフ用紙''
-''ロート、濾紙、注射器つき滅菌フィルター'':マイタケ抽出...
#br
|CENTER:&ref(fig3.jpg);&aname(fig3);|
|CENTER:''図3.マイクロプレートリーダー''|
***手順 [#z3588fcb]
+ ''茶碗蒸し実験の準備''
++卵液50mlの入ったビーカー2個を用意し、一方にマイタケ断...
++マイタケを入れた時間を記録しておく。
|CENTER:&ref(fig4.jpg);&aname(fig4);|
|CENTER:''図4.茶碗蒸し実験の準備''|
|CENTER:左)対照 右)マイタケ入り|
#br
+''検量線のためのタンパク質溶液調整''
++マイクロチューブ5本にA-1〜A-5の記号をつける。
++A-1〜A-5のチューブに緩衝液をP20のマイクロピペッターで15...
++A-1のチューブにタンパク質溶液15µlを加え、マイクロ...
#br
CENTER:&aname(table1);''表1.検量線のためのタンパク質2倍...
|BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(White):CENTER:チューブNo.|BGCOLOR...
|タンパク質濃度(μg/ml)|RIGHT:720|RIGHT:360|RIGHT:180|RIGH...
#br
|CENTER:&ref(マイタケ希釈3.jpg);&aname(fig5);|
|CENTER:''図5.2倍希釈系列の作成法''|
#br
+''吸光度測定''
++16ウェルストリップのタブに切り込みがある側を左にして、...
++16のすべてのウェルに染色液をP1000のマイクロピペッタ...
++各ウェルに、入れる溶液を、[[表1>#table1]]、[[表2>#tab...
#br
|CENTER:&ref(fig6.jpg);&aname(fig6);|
|CENTER:''図6.16ウェルストリップと入れる溶液''|
#br
++マイクロチューブを3本用意してB-1からB-3の記号をつける。
#br
CENTER:&aname(table2);''表2.実験溶液の組み合わせ''
|BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(White):CENTER:チューブNo.|BGCOLOR...
|基質 300 µl|CENTER:タンパク溶質液|CENTER:緩衝液|C...
|酵素 300 µl|CENTER:マイタケ抽出液|CENTER:マイタケ...
#br
++基質として、B-1とB-3のチューブには、タンパク質溶液300&...
++B-1に酵素液として、マイタケ抽出液300µlを加えたら...
++B-2に酵素液として、マイタケ抽出液300µlを加えた...
++B-3は、酵素液のかわりに、緩衝液300µlを加えたら...
++A-1からA-5および緩衝液も10µlをとり、対応するウェ...
++最後の溶液をウェルに入れてから5分経過後、16ウェルストリ...
#br
|CENTER:&ref(fig7.jpg);&aname(fig7);|
|CENTER:''図7.反応後の16ウェルストリップ''|
#br
#br
|&ref(graph1.jpg);&aname(graph1);|
|CENTER:''グラフ1.タンパク質濃度と595nmの吸光度による検...
#br
CENTER:&aname(table3);''表3.タンパク質濃度と吸光度の関...
|BGCOLOR(#c0504d):COLOR(white):CENTER:タンパク質濃度&br;...
|CENTER:吸光度| ...
#br
CENTER:&aname(table4);''表4.B-1マイタケ抽出液によるタン...
|BGCOLOR(#c0504d):COLOR(white):CENTER:反応時間|BGCOLOR(#c...
|CENTER:吸光度| ...
|CENTER:タンパク質濃度(μg/ml)||||||
|CENTER:タンパク質濃度の変化量|CENTER:0|||||
#br
CENTER:&aname(table5);''表5.B-2、B-3 のタンパク質濃度...
|BGCOLOR(#c0504d):|>|BGCOLOR(#c0504d):COLOR(white):CENTER...
|BGCOLOR(#c0504d):COLOR(white):CENTER:反応時間|BGCOLOR(#c...
|CENTER:吸光度| ...
|CENTER:タンパク質濃度(μg/ml)|||||
|CENTER:タンパク質濃度の変化量|CENTER:0||CENTER:0||
#br
|&ref(graph2.jpg);&aname(graph2);|
|CENTER:''グラフ2.タンパク質濃度変化量と反応時間''|
#br
+''茶碗蒸しの作成''&br;
1.で準備した卵液を湯気の立った蒸し器に入れ、強火1分加熱...
#br
|CENTER:&ref(fig8.jpg);&aname(fig8);|
|CENTER:''図8.マイタケ入り茶碗蒸し'' &br;左)卵液のみ(...
*** ポイントやトラブルシューティング [#l10d0804]
- &aname(attention1);[[注1>#attention1r]]:検量線を描く...
- &aname(attention2);[[注2>#attention2r]]:基質と酵素液...
- &aname(attention3);[[注3>#attention3r]]:0分後B-1の溶...
- &aname(attention4);[[注4>#attention4r]]:計測器からで...
#br
*** 実験を成功させるための留意点 [#t0749802]
'' 実験前''
- マイタケ抽出液は、内在の余分なタンパク質を分解させるた...
'' 実験中''
- マイクロピペッターのチップは、溶液ごとに交換するように...
'' 実験後''
-タンパク質比色検定試薬は所定の廃液ビンに集め、流しなどに...
** 本実験の発展 [#m23ce232]
- 他の種類のキノコで同様の実験を行うことで、キノコの種類...
**資料 [#r99bc2ab]
***試薬調整法 ([[Flash Movie>#movie]]) [#cb32ab58]
-''緩衝液(PBS, pH7.0)&aname(med1);'' (1ml /2人):反応...
|BGCOLOR(#4f81bd):COLOR(White):CENTER:10倍濃度PBS|BGCOLOR...
|KCl|RIGHT:0.2g|
|KH&subsc{2};PO&subsc{4};|RIGHT:0.2g|
|NaCl|RIGHT:8g|
|Na&subsc{2};HPO&subsc{4};・12H&subsc{2};O|RIGHT:2.9g|
|>|蒸留水で100mlにメスアップ|
#br
-''タンパク質溶液 (1440 µg/ml BSA ウシ血清アルブ...
BSAのグラムに合わせて、溶解させる蒸留水の量を濃度が1440 &...
#br
-''タンパク質比色検定試薬&aname(med3);'' (3.2ml/2人)...
タンパク質の定量にはBradford法を用いる。この方法はタンパ...
#br
-''卵液&aname(med4);'' (100ml/2人):
全卵をほぐし、3倍量の水道水(または、だし汁)で希釈し、茶...
#br
-''マイタケ抽出液&aname(med5);''(600µl/2人):
子実体100gを細かく刻み200 mlの緩衝液を加え、室温で約1時...
#br
&aname(movie);
#flash(マイタケ抽出液の作り方.swf,640x480,loop="true")
''図9.Flash Movieによるマイタケ抽出液の作り方''&br;
#br
''画面左下のアイコンについて''&br;
&ref(生物学実験/アイコン/右2.jpg,,70%);3秒間隔の自動で...
&ref(生物学実験/アイコン/停止.jpg,,70%);そのページで停止...
&ref(生物学実験/アイコン/右1.jpg,,70%);手動で次のページ...
&ref(生物学実験/アイコン/左.jpg,,70%);一つ前のページに戻...
RIGHT:再生には[[Adobe Flash Player>http://get.adobe.com/j...
#br
*** 参考文献 [#u3035811]
-[[文献1>#paper1r]]&aname(paper1);:大野信子、仁平佳奈、...
-[[文献2>#paper2r]]&aname(paper2);:農林水産省消費安全技...
(http://www.famic.go.jp/public_relations_magazine/kouhou...
*** 用語解説 [#ae8e1340]
:&aname(term1);[[菌類>#term1r]]|細胞壁を持ち、動物のよう...
:&aname(term2);[[分解者>#term2r]]|動植物の遺体や排泄物な...
:&aname(term3);[[菌糸>#term3r]]|キノコ(カビも同様である...
:&aname(term4);[[子実体>#term4r]]|キノコは胞子を効率よく...
:&aname(term5);[[マイクロプレートリーダー>#term5r]]|光源...
:&aname(term6);[[ウシ血清アルブミン(BSA)>#term6r]]|血清...
*** 印刷用PDFマニュアル [#w1196e7e]
&ref(マイタケ.pdf);
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